摘要目的:利用规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统构建磷酸酶-张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因稳定敲除的人胆管上皮细胞H69细胞系,检测PTEN基因敲除对人胆管上皮细胞生物学功能的影响,并探索其可能的作用机制.方法:建立sgRNA-PTEN重组质粒并包装成慢病毒感染H69细胞,经嘌呤霉素筛选获取PTEN基因稳定敲除细胞系,通过免疫印迹(Western blot,WB)检测PTEN蛋白的敲除效率,观察细胞生长情况及形态学改变,利用细胞增殖实验和平板克隆形成实验检测PTEN基因稳定敲除细胞的增殖能力,通过WB检测敲除PTEN基因对AKT信号通路和ERK信号通路蛋白的影响.结果:WB检测PTEN蛋白敲除效率显示,感染sgRNA 2慢病毒的单细胞克隆中未检测到PTEN蛋白表达,而感染sgRNA 1慢病毒的单细胞克隆中仍存在部分PTEN蛋白表达,提示成功构建稳定敲除PTEN基因的H69细胞株.克隆形成实验结果显示:与WT组比较,PTEN-KO组细胞克隆形成数目增加,差异有统计学意义(P＜0.05);MTS检测结果显示,与WT组比较,PTEN-KO组细胞增殖能力显著增强,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞形态学观察结果显示,与WT组比较,PTEN-KO组细胞呈更为明显的长梭形,细胞质更为饱满,并伴有部分伪足形成.与WT组比较,PTEN-KO组磷酸化AKT蛋白(包括p-AKT 308和p-AKT 473)表达水平显著增加,而总AKT蛋白水平未发生显著变化;磷酸化ERK蛋白和总ERK蛋白表达水平均未出现显著变化,提示PTEN基因的敲除AKT信号通路被显著激活,但对ERK信号通路无显著影响.与WT组比较,PTEN-KO组N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达水平显著上调.结论:PTEN基因敲除促进细胞增殖和触发细胞形态改变,此过程可能与其激活AKT通路和诱导上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)有关.