摘要本研究利用反向遗传学的方法成功拯救了一株盖塔病毒(Getah virus,GETV)(GenBank:OM363683).首先,将优化后的病毒序列克隆到含有T7或CMV启动子的低拷贝质粒pFK中,分别命名为T7-GETV和CMV-GETV.以T7-GETV为模板,通过体外转录(in vitro transcription,IVT)合成病毒RNA.随后,采用脂质体转染的方式将RNA递送到BHK-21细胞中,通过半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)法测定病毒滴度,并利用免疫印迹法(western blot,WB)检测病毒蛋白E1表达,证明盖塔病毒被成功拯救.进一步通过光学显微镜观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),以及TCID50法、实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和WB的方法,系统地表征盖塔病毒的生长特征.此外,在CMV-GETV的基础上,基于盖塔病毒复制子的结构,采取保留非结构蛋白基因并用报告基因mCherry或renilla luciferase(Rluc)代替结构蛋白基因的策略构建盖塔病毒复制型表达载体,分别命名为pFK-GETV-mCherry和pFK-GETV-Rluc.随后构建pFK质粒的CMV启动子并仅插入报告基因的对照质粒,分别命名为pFK-mCherry和pFK-Rluc.Image J软件分析显示,转染pFK-GETV-mCherry后单细胞平均荧光强度比转染pFK-mCherry高约5倍.同时,RT-qPCR结果表明,转染pFK-GETV-mCherry后mCherry基因转录水平也比转染pFK-mCherry高约5倍,两组结果高度一致.WB结果进一步说明,在相同时间点转染pFK-GETV-mCherry组mCherry蛋白表达水平比转染pFK-mCherry组高.荧光素酶检测显示,转染pFK-GETV-Rluc后细胞表达Rluc的效率比转染pFK-Rluc高约3个数量级.本研究为后续盖塔病毒研究提供了有力的反向遗传学工具,同时验证了盖塔病毒复制型表达载体提高外源基因表达水平的能力,为研究盖塔病毒复制型DNA疫苗奠定了基础.