换一批野生型CENP-E基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选研究
Construction and Identification of CENP-E Targeted Recombinant Plasmids for RNA Interference
摘要目的 为探索有丝分裂中的重要基因CENP-E在非整倍体的形成及肿瘤发生中的作用,设计并构建了以野生型CENP-E中Q2-Q3片段为靶点的RNA干扰表达载体pCENP-Es,筛选其中对野生型CENP-E有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的野生型CENP-E中Q2-Q3片段的mRNA序列,选择设计4条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到载体pgenesil-1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒pDSRED-Q2-Q3共转染293T细胞,72 h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过RT-PCR方法检测不同干扰质粒对野生型CENP-E mRNA的干扰效果.结果 4个野生型CENP-E的siRNA片断被成功克隆到pgenesil-1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.RT-PCR结果表明,针对1号和4号干扰质粒共转染时干扰效果最好,干扰效率可达84.47%.结论 成功构建了能表达野生型CENP-E shRNA(small hairpin RNA)重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到干扰效果达80%以上的干扰片断,为体内研究CENP-E基因及蛋白在肿瘤发生过程中功能打好基础.
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发布时间
2010-09-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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