换一批
换一批CORRECT介导的人HBB-28基因定点突变细胞株的建立及其应用
Construction and Application of CORRECT-mediated Human HBB-28 Gene Site-directed Mutagenesis Cell Line
摘要为利用CRISPR/Cas9系统建立一种新型、高效的定点突变和基因修复的新方法——引入阻断突变碱基的CORRECT(Consecutive re-Guide or re-Cas steps to Erase CRISPR/Cas blocked Targets)方法,本研究使用规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)在线设计工具,针对人β-珠蛋白(HBB)基因设计小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建PX459-sgRNA-Cas9共表达质粒,然后以含阻断突变碱基(G>T)的单链寡核苷酸(single-stranded Oligo DNA Nucleotides,ssODNs)为同源模板,通过脂质体转染HEK293T细胞,并通过Sanger测序和酶切(T7EⅠ和AatⅡ)检测编辑效率,最后通过Sanger测序分析敲除HBB单克隆细胞的基因型.结果表明,成功构建β-地中海贫血(简称β-地贫)HBB-28(A>G)基因纯合定点突变的HEK293T细胞株.阻断突变碱基优化的ssODNs减少Cas9蛋白对靶点的再次编辑,提高了整合效率.本研究建立的新型点突变技术可以高效获得纯合定点突变的HEK293T细胞株,既为单碱基突变疾病模型的建立提供实验依据,又为基因修复治疗提供高效的方法.
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