摘要背景和目的 前期研究表明人组织激肽释放酶1(hTK1)基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了.本研究构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠VSMC中的表达,以及对VSMC生长增殖影响.方法 采用限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ,酶切含启动子CMV和hTIMP1基因片段的重组穿梭质粒,经PCR、连接、热激、转化等亚克隆至pDC316-hTK1质粒中,构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组穿梭质粒.将骨架质粒和穿梭质粒于293A细胞包装重组腺病毒载体.感染大鼠VSMC后,采用Realtime-PCR法、Western blot法检测目的基因转录、蛋白表达.细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞增殖.结果 经PCR、酶切和测序法证实,含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组病毒穿梭质构建正确.在293A细胞中成功包装出重组腺病毒载体Ad-hTK1-hTIMP1.感染VSMC后,双基因(hTK1和hTIMP1)的转录水平表达呈现随感染复数(50～150 MOI)和时间(1～3 d)依赖性地增加,目的蛋白(hTK1和hTIMP1)亦呈现浓度依赖性地高表达.与单基因载体(Ad-hTK1或Ad-hTIMP1)相比较,双基因载体可明显抑制血小板源性生长因子(PDGF)诱导的大鼠VSMC增殖(P＜0.01),其峰值抑制率为45.7％.结论 首次成功构建并包装重组腺病毒双基因载体Ad-hTK1-hTIMP1.感染细胞后,其目的基因和蛋白均呈现独立高表达,并具有协同抑制VSMC增殖的效应,为血管增殖性疾病的多基因干预治疗实验提供一个新工具.