L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

Heterologous expression of L-proline-4-hydroxylase and optimization of its catalysis conditions for improved trans-4-hydroxy-L-proline biosynthesis

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摘要L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用.本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力.通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 mLpH 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/L α-KG,0.8 mmol/L FeS04·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86％.该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-Hyp奠定了一定的技术基础.