大鼠 Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3 FLAG 质粒的构建、基因结构分析及鉴定

Construction of Ad-CN1035-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3 FLAG Plasmid in Rat and An Analysis of Its Gene Structure

二维码有效期 120s

摘要目的：大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG基因重组表达质粒的构建及其基因结构分析。方法：通过UCSC（ http：//genome. ucsc. Edu/）分析大鼠瞬时受体电位通道4（ TRPC4）及其家族基因组结构，并通过NCBI确定了TRPC4的蛋白结构域，通过BioGPS（ http：//biogps. org/#goto=welcome）分析其表达模式；PCR扩增大鼠TRPC4蛋白编码区域（ CDS），并通过限制性内切酶与穿梭载体pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG进行连接，其产物转化细菌感受态细胞；挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，并对阳性克隆进行测序验证，测序正确的克隆即为目的质粒，命名为pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG；将该质粒转染HEK293细胞进行腺病毒包装，并命名为Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG，通过 Western blot验证蛋白的表达。结果：生物学分析发现TR-PC4蛋白保守的TRP-2、ANK及TRP结构域，通过BioGPS分析发现TRPC4在杏仁核和海马中表达明显，在血管内皮细胞中也有表达；PCR克隆获得3000 bp 的 TRPC4 CDS 序列，CDS 被亚克隆到表达载体 pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG中，酶切鉴定及测序验证正确；进行腺病毒包装后的病毒可以在HEK293细胞中表达TRPC4-EGFP-3FLAG 融合蛋白，Western blot证实其为含flag标签的蛋白且大小为128 KDa。结论：成功构建了大鼠TRPC4的腺病毒表达载体Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG。