黄曲霉基因敲除体系的构建及其RNA依赖的RNA聚合酶1基因在生长发育中的作用

Construction of gene knockout system of Aspergillus flavus and its effect of RNA-dependent RNA polymerase 1 gene in the growth and development

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摘要目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶 1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用.方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1 基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1 基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1 阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1 基因突变菌株;对RDRP1 基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量.结果获得ptrA抗性转化子 13 个;Sourthern blot鉴定 4 个为 RDRP1 基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14 相比,RDRP1 基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P＞0.05).结论 overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1 基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用.