摘要目的:探讨复方苗药九仙罗汉接骨汤对MC3T3-E1Subclone14成骨细胞增殖分化的影响以及PI3K/AKT/mTOR信号通路和细胞自噬在其中的作用.方法:选取对数生长期大鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1Subclone14,用不同浓度的复方苗药九仙罗汉接骨汤(0%～20%)干预,通过CCK8观察细胞活力确定复方苗药九仙罗汉接骨汤的最佳作用浓度;用最佳浓度复方苗药九仙罗汉接骨汤处理MC3T3-E1Subclone14细胞,将成骨细胞分为A组(成骨分化诱导组),B组(成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h组),C组[成骨分化诱导+5 mmol/L 3-甲基嘌呤(3-MA)组],D组(成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h+5 mmol/L 3-MA组)和空白对照组.采用茜素红染色检测各组相对矿化结节含量;CCK8观察各组成骨细胞增殖率;Western blot检测各组成骨分化蛋白Runx2、Osterix表达水平及自噬相关蛋白LC3、p62表达水平;q-PCR检测各组成骨分化基因Runx2、Osterix mRNA和自噬相关基因LC3、p62 mRNA及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况;免疫荧光染色检测各组LC3、p62在细胞内的表达情况;透射电镜检测各组细胞内自噬小体的形成情况.结果:复方苗药九仙罗汉接骨汤能促进成骨细胞的增殖、分化,浓度为10%效果最明显(P<0.01).成骨分化诱导组矿化结节形成明显多于空白对照组.与成骨分化诱导组相比,复方苗药九仙罗汉接骨汤组矿化结节形成明显增加(P<0.01),细胞增殖率明显升高(P<0.01).与成骨分化诱导组相比,复方苗药九仙罗汉接骨汤上调成骨分化标志物Runx2、Osterix及自噬相关标志物LC3蛋白及基因的表达(P<0.01),同时下调p62蛋白及基因的表达(P<0.01).加入3-MA抑制自噬后能够拮抗这些效应.免疫荧光显示,与成骨分化诱导组相比,复方苗药九仙罗汉接骨汤组能够促进LC3在细胞内的表达(P<0.01),同时抑制p62在细胞内的表达(P<0.01);加入3-MA后,抑制LC3在细胞内的表达(P<0.05),同时促进p62在细胞内的表达,且细胞增值率及活性明显降低(P<0.01).透射电镜显示复方苗药九仙罗汉接骨汤组自噬小体增加,3-MA抑制自噬小体增加.与成骨分化诱导组相比,复方苗药九仙罗汉接骨汤组PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显增加(P<0.01),加入3-MA抑制自噬后PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显减少(P<0.01).结论:复方苗药九仙罗汉接骨汤可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路和增强自噬促进MC3T3-E1Subclone14细胞成骨分化,其作用机制可能与调节Runx2、Osterix、LC3、p62蛋白及基因表达有关.