换一批低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达
Construction and Expression in Intestinal Epithelial Cells of a Recombinant Attenuated Salmonella Typhimurium Containing Hypoxia Inducible Factor 1α Gene and Human Keratinocyte Growth Factor Gene
摘要目的 构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体的减毒沙门菌菌株(Ty21a-pIRES-HIF-IRES-KGF,TPHK),观察其在防治肠黏膜损伤方面潜在的应用前景.方法 采用RT-PCR法从低氧处理A549细胞扩增HIF-1α cDNA后连接到载体pIRES-SEQ的NheI和MluI酶切位点,构建单基因重组质粒pIRES-HIF.然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板扩增KGF基因并克隆到重组质粒pIRES-HIF的XbaI 和NotI酶切位点上,获得双基因重组质粒pIRES-HIF-IRES-KGF.采用电穿孔法将pIRES-HIF-IRES-KGF质粒转入减毒沙门菌Ty21a中,通过筛选获得TPHK.该菌株转染肠上皮细胞IEC-6后48 h,用ELISA法检测上清中HIF1α和KGF的表达水平.并采用MTT方法分析不同剂量表达产物对IEC-6细胞的作用.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实TPHK构建成功.TPHK转染正常肠上皮细胞IEC-6后,48 h取上清用ELISA法检测HIF和KGF的表达,结果表明6×105个细胞可表达(16.03±1.47)ng的HIF蛋白和(17.77±1.83)ng的KGF蛋白.MTT结果表明表达上清有明显刺激正常肠上皮细胞IEC-6增殖的活性(P＜0.05),加入20%表达上清时刺激活性达高峰.结论 成功构建了TPHK,其可有效转染肠上皮细胞IEC-6,表达上清可显著促进IEC-6细胞增殖.提示TPHK具有潜在的在肠黏膜损伤局部应用的前景.
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医学主题词
细胞(Cells)低氧(Hypoxia)胞间信号肽类和蛋白质类(Intercellular Signaling Peptides and Proteins)肠黏膜(Intestinal Mucosa)基因(Genes)
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.2095-140X.2013.11.002
发布时间
2014-01-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
全军"十二五"面上项目（(CWS11C229)）
兰州军区卫生项目（(CLZ11JB04)）
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