换一批
换一批四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆
Screening of high expression clone of heterologous gene by using tetracycline resistance genotype
摘要目的：应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法：将四环素抗性基因（TetR）克隆到载体pBV220中构建筛选载体pBV223；根据氨基酸密码子的简并性，在保持原有氨基酸序列不变的情况下，人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库，以hGM-CSF基因为例进行筛选。把hGM-CSF cDNA简并文库克隆到pBV223中的TetR上游位置，构建pBV223/hGM-CSF克隆文库，导入大肠杆菌DH5α中，构建转基因的细菌文库，在不同质量浓度（20 mg/L,40 mg/L,50 mg/L,60 mg/L）的四环素培养基中培养。结果:从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV223/hGM-CSF克隆，测序结果显示该克隆的hGM-CSF cDNA 5′端序列与天然序列比较有7个碱基发生突变，且符合实验设计的要求。通过基因重组，构建成最终的高效表达克隆pBV220/hGM-CSF ，其表达hGM-CSF 的量占细菌总量的18%，较原表达水平提高80%。结论:可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。
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