优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究

Isolation of the Flanking Sequences Adjacent to Transgenic T-DNA in Brassica napus Genome by an Improved Inverse PCR Method

二维码有效期 120s

摘要[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列.[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的Ex Taq HS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比.油菜数据库比对搜索采用BBSRC BrassicaDB上WU-BLAST 2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR 数据库中WU-BLAST 2.0工具.为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R.分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证.[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0 kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%.根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点.[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列.