水稻ISA1基因的克隆与分析

Cloning and Analysis of ISA1 from Oryza sativa

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摘要[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况.[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,胚乳总RNA提取参照Bioteke公司植物多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书,用琼脂糖凝胶和Nanodrop检测RNA纯度和浓度.完整性和纯度较好的RNA样品逆转录合成cDNA第1链.根据已发表的水稻ISA1基因序列设计引物IsoaF1和IsoaR1,用于扩增包含全长ORF在内的ISA1 cDNA序列.利用Takara LA PCR试剂在25 μl的体系中进行PCR反应.目标片段经切胶回收后连接到pGEM-T easy载体,转化后进行测序鉴定.利用DNAstar进行序列分析和同源性比对,基因结构与染色体定位分析采用Gramene数据库,核酸和蛋白质序列BLAST检索采用NCBI数据库.利用Clustal W比对和NJ方法在MEGA4中构建系统进化树.利用半定量RT-PCR分析ISA1基因在水稻不同组织(叶、根、茎和胚乳)以及在不同灌浆期胚乳(灌浆3～24 d)中的表达情况.[结果]水稻淀粉去分支酶1 cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基ISA1基因位于第8号染色体,由18个外显子组成;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～82.5%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12 d胚乳中的表达量最大.[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础.