摘要目的:作为理想的种子细胞,成纤维细胞的高效获取及纯化尤为重要.本研究通过比较改良组织块培养法(improved tissue culture method,ITCM)及酶消化培养法(enzyme digestion method,EDM)分离培养人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF),以探讨两种方法的优缺点.方法:ITCM是将剪碎的皮肤组织置0.1％II型胶原酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,对真皮组织采用0.25％胰酶于室温下再次消化15 min,待组织块贴壁于培养皿后进行培养.EDM是将剪碎的皮肤组织置0.25％胰酶中于4℃下消化过夜,分离表皮与真皮,将真皮组织再次于4℃下用0.1％II型胶原酶消化过夜,然后将组织块与酶的混合物一起过滤、挤压,用含有胎牛血清的培养基冲洗滤网,对得到的细胞悬液进行培养.ITCM与EDM均采用两种酶进行消化,但两种酶的使用顺序、消化时间及温度不同,最终接种于培养皿中进行后续培养的分别是组织块和细胞悬液.本研究利用ITCM和EDM分离、培养HFF,观察ITCM组和EDM组HFF的原代至第3代(Passage 0～Passage 3,P0～P3)的细胞形态;染色波形蛋白、CD68和角蛋白以鉴定细胞纯度;绘制P3生长曲线对比两组细胞的增殖能力.采取120 mJ/cm2的中波紫外线(medium-wave ultraviolet,UVB)照射P3 ITCM组和EDM组HFF,建立光损伤模型.根据有无照射紫外线,实验分为UVB组和未照射对照组(Control).采取二次离心法提取贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),用含不同浓度(0,2.5％,5.0％及10.0％)PPP的完全培养基对ITCM组和EDM组的HFF进行分组培养,加入PPP 24 h后用CCK-8试剂盒检测损伤细胞的增殖情况.结果:ITCM组培养至第3天时可观察到大量HFF,受杂质影响小;EDM组HFF形态的观察受到较多杂质影响;第9天时,两组细胞均可传代;两种方法体外分离培养的HFF均呈长梭形、旋涡状生长.HFF培养至P2时ITCM组和EDM组波形蛋白的阳性率比较差异有统计学意义[(97.36±0.76)％vs(99.4±0.56)％,P<0.01],CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(70.8±0.46)％vs(78.37±0.75)％,P<0.01],pan-keratin的表达分别为阳性和阴性.HFF培养至P3时ITCM组与EDM组比较,波形蛋白和角蛋白染色结果差异无统计学意义(均P>0.05),CD68的阳性率比较差异有统计学意义[(74.73±1.37)％vs(85.27±2.63)％,P<0.001].EDM组P3 HFF的增殖能力显著高于ITCM组(P<0.05).经UVB(120 mJ/cm2)照射后,两种方法获取的HFF出现光损伤改变;2.5％PPP组修复损伤细胞的能力显著高于其余浓度组(P<0.05或P<0.001).结论:与ITCM法比较,EDM法获得的HFF具有纯化速度快、增殖能力强的优点;PPP对HFF的紫外线损伤具有修复作用.实验结果可为后续临床治疗研究提供理论依据.