摘要目的:膀胱癌是一种常见恶性肿瘤,发病率高且预后较差.N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰广泛参与各种生理过程,其中m6A识别蛋白YTH N6-甲基腺嘌呤RNA结合蛋白F2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein F2,YTHDF2)在膀胱癌进展中发挥重要作用.本研究深入探究O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修饰的YTHDF2调控下游靶基因周期昼夜节律调节器1(period circadian regulator 1,PER1)进而影响膀胱癌细胞增殖的分子机制.方法:采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)预测YTHDF2在膀胱癌的表达.采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白质印迹法或免疫组织化学染色检测YTHDF2、PER1和增殖相关蛋白质[增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、微小染色体维持复合体组分2(minichromosome maintenance complex component 2,MCM2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)]在临床水平(20对膀胱癌和癌旁正常组织)和细胞水平[正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)和膀胱癌细胞(T24、5637、EJ-1、SW780、BIU-87)]的表达.敲低5637和SW780细胞中的YTHDF2,采用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、平板克隆和EdU检测细胞增殖情况.采用生物信息学预测YTHDF2的糖基化修饰位点,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)检测临床组织及细胞中YTHDF2蛋白的O-GlcNAc修饰水平.采用DMSO、OSMI-1(抑制糖基化)、Thiamet G(促进糖基化)处理膀胱癌细胞并加入放线菌酮(cycloheximide,CHX),IP检测YTHDF2泛素化水平.对膀胱癌细胞进行YTHDF2的敲低及Thiamet G处理,检测PER1 mRNA稳定性、PER1 m6A修饰及细胞增殖情况.TCGA网站预测组织中PER1的表达水平;SRAMP网站预测PER1可能存在的m6A修饰位点.甲基化RNA免疫沉淀(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)检测PER1 m6A修饰水平;最后检测敲低YTHDF2和PER1对5637和SW780细胞增殖的影响.结果:与癌旁正常组织比较,YTHDF2在膀胱癌组织中的mRNA表达水平上调2.5倍,蛋白质水平升高2倍,且O-GlcNAc修饰水平增加3.5倍(均P<0.01).YTHDF2在膀胱癌细胞系中上调,且敲低YTHDF2抑制膀胱癌细胞活力(P<0.001),下调增殖相关蛋白PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05),细胞克隆数较正常组降低3倍(P<0.01),抑制细胞增殖.YTHDF2在膀胱癌细胞中O-GlcNAc修饰水平升高.OSMI-1显著降低YTHDF2蛋白稳定性(P<0.01),促进其泛素化;Thiamet G则发挥相反作用(P<0.001).添加Thiamet G可以逆转敲低YTHDF2引起的细胞功能变化,促进膀胱癌细胞增殖(P<0.01),上调PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05).YTHDF2靶向识别PER1 m6A修饰进而促进PER1 mRNA的降解.回复实验结果显示敲低PER1逆转敲低YTHDF2对膀胱癌细胞增殖的抑制,促进膀胱癌细胞增殖(P<0.001),上调PCNA、MCM2、CCND1的表达(均P<0.05),提示YTHDF2通过调节PER1促进膀胱癌细胞的增殖.结论:O-GlcNAc修饰的YTHDF2通过m6A修饰下调抑癌基因PER1,进而促进膀胱癌的发展.