换一批
换一批大肠杆菌不耐热肠毒素基因克隆和无毒突变体mLT63的构建及序列分析
Clonging gene for E. coli heat-labile enterotoxin and constructing its site-directed mutant mLT63 and analysis of their nucleotide sequences
摘要目的:大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是很强的免疫原,也具有很强的粘膜免疫佐剂作用,但LT的毒性限制了它在人类疫苗中使用.本研究希望通过定点诱变构建无毒或减毒并保持LT免疫学特性的突变体.方法:以人源肠毒素大肠杆菌(ETEC)菌株E.coli 44815为研究对象,应用本研究室改进的SDS裂解法小量制备含LT基因的野生大质粒,PCR扩增LT基因,构建重组质粒pNEB193-elt;采用重叠延伸法PCR对LT第63位氨基酸进行体外定点诱变,构建LT突变基因的重组克隆载体,测序并进行序列分析鉴定.结果:采用本研究室改进的SDS裂解法,可成功地小量提取满足扩增模板要求的大质粒;所克隆的LT基因与GenBank公布的一致;定点诱变正确,无非特异性突变.结论:克隆的LT野生基因和定点诱变基因可用于构建重组表达载体,表达重组蛋白,对其粘膜免疫佐剂性或其他相关特性进一步研究.
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