换一批基于CRISPR检测系统的PER信号放大方法探究
Research on PER Signal Amplification Method Based on CRISPR Detection System
摘要目的 采用成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白Cas13a(CRISPR-Cas13a)联合级联引物交换反应(PER),建立一种基于CRISPR-Cas13a系统的检测信号放大并直接检测新型冠状病毒的方法,即CRISPR/PER.方法 筛选新型冠状病毒模板链及针对模板链设计2条特异性CRISPR相关RNA(crRNA),利用Cas13a蛋白的切割活性,对CRISPR反应体系进行条件优化;对PER的配对发卡结构及引物进行筛选,利用筛选后的配对进行PER体系优化并设计特异性探针P2探针和P3探针,利用碱基互补配对使信号探针P3与扩增的发卡结构H27结合,形成反应液,制备胶体金试纸条,并评价CRISPR/PER方法的灵敏度与特异度.结果 RNA的最佳配对crRNA为crRNA-1;500 nmol·L-1 Cas13a蛋白加入 1 μL、4 g·L-1 的 crRNA 加入 0.5 μL、5 U Ribonuclease Inhibitor 加入 1 μL 为 CRISPR 反应体系的最适加入量;H27发卡结构与P27引物的配对效果最好;最适条件为37 ℃,反应40 min;各组最适加入量分别为4 U Bst DNA聚合酶加入1 μL、5 μmol·L-1 H27 发卡结构加入 10 μL、100 mmol·L-1 MgSO4 加入 1 μL、dNTP 加入2 μL时扩增效率最好.CRISPR/PER方法可在1.5 h左右完成检测,检测新型冠状病毒模板链的最低检测限为100 μg·L-1;特异性实验表明与3种对照病毒均无交叉反应.结论 CRISPR/PER检测方法在新型冠状病毒检测上具有方便快捷,特异性强等优点,可作为核酸检测新方法探究的参考.
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关键词
成簇规律间隔短回文重复序列引物交换反应核酸检测新型冠状病毒扩增clustered regularly interspaced short palindromic repeatsprimer exchange reactionnucleic acid detectionnovel coronavirusamplification
分类号
R440（诊断学）
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1004-437X.2025.05.002
发布时间
2025-04-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
河南省重点研发与推广专项(科技攻关)基金资助项目（222102310164）
河南省重点研发与推广专项(科技攻关)基金资助项目（232102311036）
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