摘要目的 探究壳寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)的免疫佐剂效果,包括免疫激活作用和引发溶酶体逃逸作用,并探索其是否可以作为减毒活菌载体疫苗佐剂.方法 ①以0(对照组)、0.1～4 mg/mL COS培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞24 h,利用CCK8实验检测细胞活力的影响;以0(对照组)、1、2、4 mg/mL COS干预小鼠RAW264.7细胞24 h,通过RT-qPCR实验检测细胞因子IFN-γ、IL-10、TGF-β、TLR-4的mRNA表达水平.②RAW264.7细胞加入1 mL含有不同组分[钙黄绿素(Calcein)50 μg/mL,COS 2 mg/mL,阻断剂bafilomycin A1 1 μmol/mL]的PBS培养,分组为Calcein组、Calcein+COS组、Calcein+COS+Bafilomycin A1组.通过激光共聚焦显微镜观察RAW264.7细胞在有或无COS干预下对荧光染料Calcein的吞噬和胞内荧光分布情况,判断COS是否能够引发溶酶体逃逸.③用0.5、1、2、4、8 mg/mL COS包被减毒李斯特菌载体宫颈癌治疗性疫苗候选株LM?E6E7和LI?E6E7,测定Zeta电位变化,选择COS成功包被细菌的质量浓度.检测 2 mg/mL COS包被LM?E6E7和LI?E6E7前后,RAW264.7细胞对疫苗菌株的吞噬率.结果 ①CCK8结果显示,与对照组相比,不同质量浓度COS干预RAW264.7细胞24 h后,对细胞无毒性,并能够促进细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05);RT-qPCR结果表明,与对照组相比,COS干预能够上调RAW264.7细胞TLR-4和IFN-γ的mRNA水平,同时抑制TGF-β和IL-10的mRNA表达水平,以4 mg/mL COS组最为明显(P＜0.05).②激光共聚焦显微镜发现在COS干预下,Calcein+COS组比Calcein组有更多的荧光染料从溶酶体内释放进入胞内,而这个过程可以被bafilomycin A1阻断.③Zeta电位结果表明COS质量浓度达到2 mg/mL时,能成功包被到细菌表面.疫苗株被COS包被前、后,RAW264.7细胞对LM?E6E7的吞噬率分别为5.70%和22.00%,差异有统计学意义(P＜0.05);RAW264.7细胞对LI?E6E7的吞噬率分别为1.55%和6.12%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 COS具有激活巨噬细胞免疫应答和引发溶酶体内物质逃逸溶酶体的作用,包被减毒活菌载体疫苗候选菌株可促进巨噬细胞对细菌的吞噬,可望进一步开发作为细菌载体类疫苗佐剂.