摘要目的 建立基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)和CRISPR/Cas12a蛋白的一步检测法,实现对人乙型流感病毒即时灵敏的检测.方法 根据人乙型流感病毒(维多利亚系)保守基因(NS1基因)设计RPA扩增引物,首先以标准质粒为模板建立反应体系,在37℃条件下孵育15 min进行RPA扩增;通过瞬时离心将管盖上的CRISPR/Cas12a体系与管底的RPA扩增产物充分混匀,在37℃进行实时荧光检测.对反应条件进行优化,建立人乙型流感病毒RPA-CRISPR/Cas12a一步检测法;以标准质粒和假病毒为模板,评价方法灵敏度;以其他发热呼吸道症候群病毒为模板,评价方法特异度;通过对真实样本的检测,评价一步检测法与RT-qPCR检测结果的一致性.结果 成功建立基于RPA-CRIPSR/Cas12a的一步检测法,反应温度为37℃,Cas12a/crRNA浓度比例为1∶1,Cas12a浓度为120 nmol/L,单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)探针浓度为300 nmol/L,引物浓度为480 nmol/L时最佳,25 min可检测低至2.8 copies/μL的标准质粒DNA,30 min可检测低至2.77 copies/μL的假病毒;特异性强,与新型冠状病毒、甲型流感病毒H1N1、呼吸道合胞病毒A型无交叉反应;检测真实样本的灵敏度为93.33％,特异性为100％,与RT-qPCR检测结果一致率为97.14％.结论 本研究建立的基于RPA-CRISPR/Cas12a的一步检测法,30 min即可完成人乙型流感病毒真实样本核酸释放、逆转录、等温扩增、CRISPR/Cas12a系统切割并输出荧光信号的完整检测流程,具有较高灵敏度和特异性,并成功应用于临床样本,在实现病毒即时检测方面具有良好的应用前景.