换一批
换一批优化近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器提升编辑效率
Optimize nearly P AM-less adenine base editor to improve editing efficiency
摘要目的 探究替换近乎PAM-less腺嘌呤碱基编辑器(ABE)不同元件对其编辑效率的影响.方法 在SpRY-ABEmax中,以Tad-8e替换ABEmax构建SpRY-ABE8e,在此基础上将Cas9蛋白变体SpRY与Tad-8e之间的连接肽3xGGS-XTEN-3xGGS改为长度缩短的PAPAPA连接肽.将ABEs和sgRNA表达质粒共转染人胚肾细胞HEK 293T,24 h后加入1.5μg/mL嘌呤霉素并于72 h后通过流式分选表达绿色荧光蛋白的细胞,提取细胞基因组并使用PCR扩增技术在预期产生编辑的位点进行扩增,采用Sanger测序并使用Beat工具预估各个位点编辑效率情况.结果 与对照组SpRY-ABEmax相比,SpRY-ABE8e编辑效率提升,编辑窗口也扩大(P<0.05);通过使用长度缩短的连接肽可以在保持编辑效率提升的同时限制SpRY-ABE8e的编辑窗口.结论 可通过替换PAM-less ABE不同元件来提升编辑效率,这将为今后基因治疗提供更多的工具选择.
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