阿德福韦酯持续干预对HepG2.2.15细胞经典耐药突变的诱导作用

Classical drug resistance mutations of HepG2.2.15 cells persistently induced by appropriate concentrations of adefovir

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摘要目的观察HepG2.2.15细胞在不同浓度阿德福韦酯(ADV)持续诱导下发生经典耐药突变的情况,并探讨其产生耐药的机制.方法用不含或含0.01、0.1、1.0μmol/L ADV的培养基于12孔板中培养HepG2.2.15细胞,每3d传代,共培养至110代,分别抽提细胞和上清中的HBV DNA,每10代取样1次.以不降解质粒的ATP依赖性DNA酶消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法和单管巢式PCR方法分别扩增细胞内HBV cccDNA和上清中HBV DNA的反转录酶(RT)区.以PCR产物直接测序结合克隆测序法(20个克隆/样本)分析细胞内HBV cccDNA和上清HBV DNA的RT区是否产生经典ADV耐药突变.结果未经药物处理的对照组持续稳定表达HBV DNA.0.01 μmol/L ADV组和0.1 μmol/L ADV组随着ADV干预时间的延长,细胞内总HBV DNA、cccDNA及上清中HBV DNA的载量持续下降.0.01 μmol/L ADV组细胞内和上清中至110代仍未检测出耐药变异,0.1μmol/L ADV组细胞内和上清中在110代时检测到RT区发生rtA181V+N236T变异.1.0 μmol/L ADV组由于细胞生长受到抑制于第15代时停止培养.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV cccDNA循环池,用含适量浓度ADV的培养基持续培养可以诱导HepG2.2.15细胞发生经典耐药突变.