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基于CaCC的TRPV4调节剂高通量筛选细胞模型的建立

Establishment of a cell model for high-throughput TRPV4 regulator screening based on CaCC

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摘要目的构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型.方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况.应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性.加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca2+浓度;通过Z'因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选.结果 RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4.倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型.荧光淬灭动力学实验结果显示,该模型可以筛选TRPV4调节剂,斜率(Slope)值与TRPV4调节剂的浓度呈剂量依赖关系;该模型可敏感检测细胞内Ca2+的浓度变化,通过Slope值可反映细胞内Ca2+浓度的高低;Z'因子为0.728,表明该模型可高通量筛选TRPV4调节剂.结论成功构建了一种可以敏感高效筛选TRPV4调节剂的高通量筛选细胞模型.

作者肖云萍 ^[1] 解宇浩 ^[2] 张嘉琪 ^[2] 洪啟元 ^[3] 郝峰 ^[2] 王国庆 ^[4] 学术成果认领

作者单位吉林医药学院检验学院,吉林省吉林市 132013;北华大学医学技术学院,吉林省吉林市 132013 ^[1] 吉林医药学院检验学院,吉林省吉林市 132013 ^[2] 吉林医药学院公共卫生学院,吉林省吉林市 132013 ^[3] 北华大学医学技术学院,吉林省吉林市 132013 ^[4]

关键词瞬时受体电位香草酸亚型4 钙激活氯离子通道 YFP-H148Q/I152L 高通量筛选细胞模型

分类号 R915（药物基础科学）R311（医用一般科学）

栏目名称

基础研究

DOI 10.11855/j.issn.0577-7402.2020.10.02

发布时间 2020-11-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

基金项目

国家自然科学基金（81601234）吉林省教育厅项目（JJKH20170418KJ）吉林省教育厅项目（JJKH20191056KJ）创新项目（2018J113）吉林省大学生创新创业训练计划（201913706071）