摘要目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)AI662270调控衰老小鼠脂肪细胞胰岛素抵抗的机制.方法 (1)20只雄性C57BL/6小鼠随机分为青年组与老年组(n=10),青年组小鼠饲养至4月龄后采用乌拉糖麻醉后眼球取血处死,老年组饲养至18月龄后采用相同处死方式,分离附睾白色脂肪组织(eWAT)和肝组织.采用Western blotting检测肿瘤抑制基因1(p16ink4a)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21(p21kip1)的表达情况,RT-qPCR检测4个差异lncRNAs(C4a、AI662270、BATE1、Gm29719)的表达情况.取小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1,设置正常对照组(诱导分化为成熟脂肪细胞后不做处理)与衰老模型组[即阿霉素处理(ADR)组,采用0.2 μmol/L阿霉素诱导构建衰老脂肪细胞模型],采用β-半乳糖苷酶染色检测脂肪细胞的染色情况;RT-qPCR检测AI662270和衰老标志物(p16ink4a、p21kip1、p53)的表达情况;Western blotting检测磷酸化H2A组蛋白家族成员X(gama-H2AX)、p16ink4a、p21kip1蛋白的表达情况.(2)采用己糖激酶法检测小鼠血清和3T3-L1脂肪细胞培养基中的葡萄糖含量;RT-qPCR检测小鼠eWAT和脂肪细胞中胰岛素敏感性关键基因蛋白激酶B(Akt)、胰岛素受体底物1(IRS1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、葡萄糖转运体4(GLUT4)mRNA的表达情况;Western blotting检测IRS1、PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达情况.(3)采用Spearman相关分析探讨AI662270表达水平与IRS1、PI3KmRNA表达水平的相关性;构建衰老脂肪细胞AI662270低表达模型,采用RT-qPCR验证AI662270的敲低效率;采用己糖激酶法检测衰老脂肪细胞敲低AI662270后,细胞培养基中的葡萄糖含量,RT-qPCR检测Akt、IRS1、IRS2、PI3KmRNA的表达情况,Western blotting检测Akt、p-Akt蛋白的表达情况.(4)采用生物信息学分析预测AI662270的下游靶基因及二者的结合位点,RT-qPCR和Western blotting验证AI662270敲低后,其下游靶基因的表达情况.结果 (1)与青年组比较,老年组小鼠eWAT中p16ink4a、p21kip 1蛋白表达水平明显增高,eWAT和肝组织中C4a、AI662270、BATE1、Gm29719的表达水平明显增高(P＜0.05).β-半乳糖苷酶染色结果显示,与正常对照组比较,阿霉素处理的衰老脂肪细胞中蓝绿色增强,呈扩大、扁平的细胞形态;与正常对照组比较,ADR组脂肪细胞中AI662270及p16ink4a、p21kip1 mRNA表达水平明显增高,gama-H2AX、p16ink4a、p21kip1蛋白表达水平明显增高(P＜0.05).(2)与青年组比较,老年组小鼠血清中葡萄糖含量明显增加(P＜0.01);与正常对照组比较,ADR组脂肪细胞培养基中葡萄糖含量明显增加(P＜0.05);与青年组比较,老年组小鼠eWAT中IRS1、PI3K等的表达水平明显降低(P＜0.01);与正常对照组比较,ADR组脂肪细胞中IRS1、PI3K等的表达水平也明显降低(P＜0.05).(3)Spearman相关分析结果显示,AI662270表达水平与IRS1、PI3K mRNA表达水平均呈负相关(P＜0.05);RT-qPCR检测结果显示,与siNC组比较,siAI662270组脂肪细胞中AI662270的表达水平明显降低(P＜0.05),即成功构建了衰老脂肪细胞AI662270低表达模型;己糖激酶法检测结果显示,衰老脂肪细胞敲低AI662270后,细胞培养基中的葡萄糖含量明显降低(P＜0.05);敲低AI662270后,衰老脂肪细胞中IRS1、IRS2、PI3KmRNA的表达水平(P＜0.05)以及p-Akt/Akt比值明显增高(P＜0.01).(4)生物信息学预测结果显示,AI662270下游的靶基因为miR-3073b-3p;血红素加氧酶1(Hmox1)为miR-3073b-3p的靶基因;与siNC组比较,siAI662270组衰老脂肪细胞中miR-3073b-3p的表达水平明显增高,Hmox1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.01).结论 衰老可增加小鼠eWAT中AI662260的表达,且AI662260的表达与胰岛素敏感性呈负相关;AI662260敲低可降低衰老脂肪细胞培养基中的葡萄糖含量,上调IRS1、PI3K的表达,增加衰老脂肪细胞的胰岛素敏感性,其机制可能与AI662270/miR-3073b-3p/Hmox1通路有关.