换一批摘要目的:建立反向DNA-pull down方法,验证目的蛋白与靶DNA的结合,为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段.方法:以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板,通过PCR扩增获得转录因子PU.1-ETS结构域编码序列,通过酶切连接的方式连入表达质粒pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导蛋白异源表达.以小鼠基因组DNA为模板,通过PCR获得Ly96 启动子序列.将异源表达的PU.1 ETS结合至Ni-NTA磁珠后,与靶DNA—Ly96启动子体外孵育,最终经蛋白酶K酶解、DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS体外结合Ly96 启动子情况,评估反向DNA-pull down技术的可行性.结果:通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS复合物,通过PCR获得Ly96 启动子序列,经反向DNA-pull down验证PU.1 ETS与Ly96 启动子的相互结合作用.结论:以PU.1-ETS-Ly96 启动子相互作用为例,证实反向DNA pull-down技术的可行性,为探究已知蛋白与靶DNA结合和疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案.
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关键词
蛋白-DNA结合反向DNA-pull down方法异源表达PU.1转录因子protein-DNA bindingreverse DNA-pull down assayheterologous expressionPU.1 transcription factor
分类号
Q503（生物化学一般性问题）
栏目名称
DOI
10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.003
发布时间
2025-02-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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