换一批重组慢病毒载体介导KSHV分子开关蛋白Rta在BCBL-1细胞中的表达及其功能鉴定
Construction and identification of the recombinant expression lentivirus vector carrying KSHV Rta gene
摘要目的:构建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)分子开关蛋白,即复制和转录激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重组慢病毒载体.方法:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta 中扩增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,构建重组慢病毒载体pHAGE-Rta.将重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293 T细胞,通过荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的293 T细胞占总数的百分比.收集病毒悬液,采用梯度稀释法测定病毒滴度.以不同感染复数(MOI)的Lentivirus-Rta 病毒量感染BCBL-1细胞,72 h后检测Rta基因的表达,同时通过蛋白质印迹和病毒颗粒释放实验检测KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素-6(vIL-6)的表达及子代病毒颗粒的产出.结果:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta中扩增出Rta 基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后,酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta构建成功.通过慢病毒包装3质粒表达系统获得了表达Rta基因的重组慢病毒,滴度约为2×107 efu/mL.以不同MOI的重组慢病毒感染BCBL-1细胞,72 h后可检测到外源基因编码Rta蛋白的表达,且其表达能够上调KSHV vIL-6的表达水平及促进子代病毒颗粒的释放.结论:成功构建了含Rta基因的慢病毒表达载体,获得的重组病毒能够有效地感染BCBL-1细胞,并发挥激活KSHV裂解期复制的生物学功能.
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关键词
慢病毒复制和转录激活蛋白卡波氏肉瘤病毒病毒复制recombinant lentivirusreplication and transcriptional activatorKaposi's sarcoma-associated herpesviruslytic replication
栏目名称
DOI
10.13312/j.issn.1671-7783.y130238
发布时间
2015-12-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（81371824）
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