兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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摘要兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病.RHDV 属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus).目前兔出血症病毒 1 型(GI.1)和兔出血症病毒2 型(GI.2)2 种基因型均有在我国流行.为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1 型和RHDV2 型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR.结果显示,稀释度为 1×108～1×104 copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r2 为0.999;该方法对RHDV1 型和RHDV2 型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为 100～1 000 copies/μL;组内和组间变异系数在 0.01%～1.61%之间.用该方法对60 份临床肝脏样品和52 份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为 70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%).因此,该方法能够同时检测 RHDV1 型和RHDV2 型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒.