人RAF1-RAS结合域蛋白的纯化及功能验证

Purification of human RAF1-RAS binding domain protein and function verification

二维码有效期 120s

摘要目的纯化人RAF1(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)-RAS(rat sarcoma)结合域(RAF1-RAS binding domain,RAF1-RBD)蛋白并验证其功能.方法采用PCR法以人乳腺文库cDNA为模板扩增获得RAF1-RBD序列,将其插入至大肠杆菌表达载体pGEX-KG(带GST标签),获得pGEX-KG-RAF1-RBD重组质粒;转化该质粒至感受态细菌BL21(DE3),小量诱导并通过Western印迹法检测其表达;然后采用GST微珠纯化该蛋白;利用GST pull-down技术验证其与HRAS(Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog)蛋白相互作用.结果双酶切鉴定及基因测序结果均表明成功构建重组质粒pGEX-KG-RAF1-RBD;Western印迹分析及SDS-PAGE方法检测结果说明重组蛋白相对分子质量(Mr)约42000,与预期大小一致;GST pull-down技术证明RAF1-RBD与HRAS在体外能够结合.结论纯化的人RAF1-RBD蛋白与HRAS在体外存在相互作用.

作者刘娟 ^[1] 胡海兰 ^[2] 赵思源 ^[3] 李晓希 ^[2] 张丽芳 ^[4] 徐小洁 ^[5] 孙万军 ^[2] 学术成果认领

作者单位火箭军特色医学中心血液科,北京 100088;军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京 100850 ^[1] 火箭军特色医学中心血液科,北京,100088 ^[2] 海军92076部队卫生队,北京,102202 ^[3] 河北省军区石家庄第六离职干部休养所,石家庄,050081 ^[4] 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京,100850 ^[5]

关键词人RAF1-RBD蛋白原核表达纯化 HRAS 蛋白相互作用

主题词蛋白(Egg White)人(Persons)质粒(Plasmids)大鼠(Rats)肉瘤(Sarcoma)

分类号 R392-33 Q782

栏目名称论著

DOI 10.7644/j.issn.1674-9960.2019.03.006

发布时间 2019-08-27

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