人血小板第4因子基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

Construction of human PF4 gene promoter-GFP reporter vector and analysis of transcription activity of the promoter

二维码有效期 120s

摘要目的构建人血小板第4因子(PF4)基因启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性.方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5'端非编码区包含转录起始位点在内的-245～+49 bp的DNA序列.以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP.将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性.结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株.流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[(5.467±0.2603)％],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[(24.93±2.571)％].结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础.

作者姜佳楠 ^[1] 覃金华 ^[2] 范增 ^[3] 何丽娟 ^[3] 岳文 ^[3] 郑敏 ^[1] 李艳华 ^[2] 裴雪涛 ^[3] 学术成果认领

作者单位电子科技大学医学院,成都,610054 ^[1] 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所,北京100850;华南生物医药研究院华南干细胞与再生医学研究中心,广州510005 ^[2] 华南生物医药研究院华南干细胞与再生医学研究中心,广州510005;军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所,北京100850 ^[3]

关键词血小板因子4 巨核细胞绿色荧光蛋白质类

分类号 R331.2 Q78

栏目名称

论著

DOI 10.7644/j.issn.1674-9960.2019.10.003

发布时间 2020-07-07

基金项目

国家重点研发计划（2017YFA0103100,03,04）；国家自然科学基金（31801227,81872553）；北京市自然科学基金（7194303）