换一批利用CRISPR/Cas9敲除文库筛选发现一种新的辐射敏感性调控基因BAG3
CRISPR/Cas9-based knockout library screening identifies BAG3 as a potential regulator of radiosensitivity
摘要目的 利用规律成簇间隔短回文重复及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统介导的敲除文库筛选,鉴定电离辐射敏感性调控基因.方法 查找京都基因与基因组百科全书(KEGG)、生物分子通路知识数据库(Reactome)和基因本体论(GO)数据库,确定987个机体应激反应调控基因,每个基因设计6条单向导RNA(sgRNA)序列,构建sgRNA质粒并包装为慢病毒文库.以结肠癌细胞系Caco-2为模型,构建Caco-2-Cas9稳定转录细胞株,感染筛选文库慢病毒后,使用嘌呤霉素选择稳定感染细胞株后进行电离辐射照射,14d后收集细胞进行基因组测序.对测序数据进行生物信息学分析,通过电离辐射后细胞计数试剂(CCK-8)细胞增殖实验、克隆形成实验、流式细胞术测定活性氧(ROS)和凋亡等方法对得到的候选基因进行辐射敏感性验证.结果 成功构建机体应激反应调控基因sgRNA慢病毒文库,进行电离辐射后的CRISPR文库筛选,获得165个候选辐射敏感基因和116个候选放射抵抗基因.利用功能实验证实Bcl2相关永生基因3(BAG3)敲除细胞相较对照细胞可以提高细胞增殖能力1.2～1.5倍,克隆形成能力提高1.5～2.0倍,ROS减少13％～25％,同时凋亡率下降32％～73％.结论 利用CRISPR/Cas9文库筛选策略获得了多种候选辐射敏感性调控基因,并证实BAG3是一种新的辐射敏感基因.该策略可以作为筛选辐射敏感性调控基因的重要工具.
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关键词
规律成簇间隔短回文重复CRISPR相关核酸酶9结肠癌基因敲除Bcl2相关永生基因3clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)CRISPR-associated nuclease 9(Cas9)colon cancergene knockoutBcl2-associated athanogene 3
栏目名称
DOI
10.7644/j.issn.1674-9960.2025.06.004
发布时间
2025-08-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家重点研发计划（2022YFA1103502）
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