换一批
换一批粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定
Cloning,Expression, Purification and Immunogenicity of House Dust Mite Allergen Der f5
摘要目的 克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 根据Der f5 基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR 方法扩增出Der f5 基因片段,PCR 产物克隆入pMD18-T 载体,转化大肠埃希菌 Top10,经PCR和酶切鉴定并测序.将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5 和空质粒pET-32a 同时用限制性内切酶Bam HⅠ与Hind Ⅲ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌 Top10.构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌 BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5 表达产生的组氨酸重组蛋白.结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f5 和pET32a-Der f5.SDS-PAGE 结果表明Der f5 基因在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE 结果显示单一条带.该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE 结合活性.结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE 结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础.
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分类号
R392.11
栏目名称
基础医学
DOI
10.3969/j.issn.1000-2294.2013.02.001
发布时间
2013-07-03
基金项目
国家863计划
国家自然科学基金
广东省自然科学基金
广东省高等学校国际暨港澳台科技合作创新平台项目
深圳市重点实验室组建项目
深圳市科技计划基础研究重点项目
深圳市南山区一般研发资助项目
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