过表达Miro1慢病毒载体的构建及Miro1高表达间充质干细胞稳定转染细胞株的建立与鉴定

Construction of Miro1 overexpression lentiviral vectors and establishment and identification of Miro1 Hi-BMSCs stable transfection cell line

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摘要背景线粒体转移是干细胞发挥免疫修复功能的重要机制之一,Miro1是线粒体转移过程的关键蛋白,但其动力学研究欠缺研究模型.目的构建过表达Miro1的间充质干细胞稳转细胞株,为线粒体动力学研究间充质干细胞的抗炎修复机制提供细胞模型.方法通过PCR扩增目的基因后进行Gibson反应、转化及Gateway等方法构建载体,并对载体进行酶切鉴定.慢病毒感染间充质干细胞后,使用嘌呤霉素进行药物筛选获得稳转细胞株.后续分为三组进行相关鉴定.(1)BMSC组:正常间充质干细胞;(2)Con-BMSC组:慢病毒空载体感染的间充质干细胞;(3)MiroHi-BMSC组:过表达Miro1的慢病毒载体感染的间充质干细胞.通过RT-qPCR、Western blot检测上述三组细胞Miro1的表达水平,并进行划痕试验、水平迁移实验、成骨及成脂诱导分化以鉴定干细胞特性.结果所构建的载体完成酶切鉴定,并成功获得过表达Miro1重组慢病毒载体pLV-EGFP:T2A:Puro-EF1A＞mRhot1/HA.经mRNA和蛋白水平检测,MiroHi-BMSC组的Miro1表达高于BMSC组和Con-BMSC组(P＜0.05),干细胞水平、垂直迁移能力三组间差异无统计学意义(P＞0.05),三组干细胞均可成功进行成脂及成骨诱导分化.结论通过慢病毒载体成功构建Miro1Hi-BMSCs稳转细胞株,且该稳转株仍保留干细胞特性,可用于间充质干细胞调控线粒体转移的相关研究.