换一批rAAV-PHP.eB病毒包装条件优化及其体外感染能力的研究
Optimization of rAAV-PHP.eB Virus Packaging Conditions and Its in Vitro Infectious Ability
摘要新型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)血清型AAV-PHP.eB,可高效靶向中枢神经系统(central nervous sys-tem,CNS),是治疗CNS相关疾病的重要病毒载体.然而,采用三质粒瞬时转染法制备AAV-PHP.eB血清型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)的转染工艺参数仍缺乏系统探究.因此,本研究针对AAV-PHP.eB血清型病毒的三质粒瞬时转染包装条件,对其中的质粒总量与质粒-PEI Max比例进行优化,通过分析平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)以及利用流式细胞术检测荧光阳性细胞的比例,确定最佳转染条件为质粒总量 4 μg/孔、质粒-PEI Max比例为 1∶3;应用最佳包装条件进行扩大生产制备的 rAAV-PHP.eB-zsGreen1/tdTomato 病毒粗液经 qPCR 检测滴度为 7.94×109 vg/mL和 7.09×109 vg/mL,SDS-PAGE证实病毒衣壳蛋白分子量符合预期理论值;通过观察荧光感染效果以及分析荧光面积占比,在体外对rAAV-PHP.eB病毒粗液感染能力进行评估,结果表明,两种病毒可有效感染AAV-293 及多巴胺能神经元细胞(MES23.5 细胞),PCR扩增验证了病毒感染 MES23.5 细胞后 zsGreen1 与 tdTomato 基因成功表达,进一步证明了rAAV-PHP.eB有效感染MES23.5 细胞.本研究建立的优化包装体系与体外感染能力的验证,可为基于rAAV-PHP.eB,靶向CNS疾病(如帕金森病)开展基因治疗研究奠定基础.
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关键词
rAAV包装条件优化rAAV-PHP.eB病毒MES23.5细胞体外感染rAAV packagingcondition optimizationrAAV-PHP.eB virusMES23.5 cellsin vitro infection
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DOI
10.13417/j.gab.044.001157
发布时间
2025-12-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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