褐飞虱细胞色素P450基因CYP4C62的原核表达及多克隆抗体的制备

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of cytochrome P450 gene CYP4C62 from Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae)

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摘要[目的]细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能.[方法]本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框(不含信号肽编码序列部分),在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白.将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体.采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性.[结果]结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD.间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000.Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性.[结论]CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础.