亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

Prokaryotic expression and characterization of prophenoloxidase from the Asian corn borer, Ostrinia furnacalis (Lepidoptera: Pyralidae)

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摘要[目的]昆虫体内酚氧化酶原(PPO)是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程.本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶(PO)抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件.[方法]利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子(Mg2+,Cu2+和Fe2+)对PPO二级结构的影响.[结果]融合蛋白PPO得到了表达和纯化.重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的Vmax为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L.Fe2+存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7％±4.6％,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6％±1.2％(P＜0.05);有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升.有Cu2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0％±1.6％,而α-螺旋结构成分则上升至35.3％±6.9％.[结论]结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响.