甜菜夜蛾拓扑异构酶Ⅰ氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响

Effects of amino acid substitutions of topoisomerase Ⅰ on its DNA relaxation activity in Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)

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摘要[目的]为了探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ,Top Ⅰ)氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响.[方法]通过克隆甜菜夜蛾TopⅠ基因,构建原核表达载体,采用完全重叠PCR定点突变技术,向甜菜夜蛾Top Ⅰ的V420,L530,A653和S729(根据人Top Ⅰ氨基酸序列编号)4个位点引入突变,将改造成功的重组TopⅠ基因转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,诱导重组蛋白表达、纯化,测定Top Ⅰ突变对其解旋活性的影响.[结果]完全重叠PCR能实现甜菜夜蛾TopⅠ定点突变.重组蛋白在体外得到稳定的表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析在96.0 kDa处出现特异性条带.通过对重组蛋白分离纯化并测定对质粒pBR322解旋酶活性,发现引入V420I,L530P和A653T突变后Top Ⅰ的比活力显著降低,而引入S729T突变后比活力与野生型蛋白无显著差异.[结论]本研究证明在甜菜夜蛾Top Ⅰ中引入V420I,L530P和A653T突变后,其对底物pBR322的解旋活性显著降低,为后期探索甜菜夜蛾Top Ⅰ的定点突变与其对喜树碱及其衍生物敏感性的关系奠定了基础.