意大利蜜蜂N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质分析

Purification and characterization of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from the Italian honey bee, Apis mellifera ligustica (Hymenoptera: Apidae)

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摘要[目标]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖糖苷酶(NAGase)是一种重要的几丁质分解酶,能从N-乙酰葡萄糖苷的非还原端催化去除β-1,4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基,参与了昆虫外骨骼的蜕皮过程.研究蜜蜂该酶的特征有助于阐明其在蜜蜂发育过程中的作用机制.[方法]采用40％-70％硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖G-100凝胶过滤层析的方法从意大利蜜蜂Apismellifera ligustica幼虫体内分离纯化NAGase.以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物检测该酶的活力,用native PAGE和SDS-PAGE检测酶的纯度.IEF-PAGE测定该酶等电点.葡聚糖G-200凝胶过滤层析测定酶的总分子量.[结果]结果显示,纯化的NAGase酶的比活力为803.09 U/mg,总分子量为77.3 kD.结合SDS-PAGE表明该酶由两个具有相同分子量(39 kD)的亚基组成.该酶等电点为4.8.酶水解底物pNP-NAG的过程遵循米氏方程,米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)分别为0.11 mmol/L和17.65 μmol/L·min.该酶水解反应的最适pH和最适温度分别为pH5.5和60℃.酶催化pNP-NAG反应的活化能为64.8 kJ/mol.pb2+,Cu2+,Zn2+和Al3+对该酶有不同程度的抑制作用.[结论]本研究描述了意大利蜜蜂NAGase的分离纯化方法及其理化性质,为进一步进行蜜蜂NAGase的结构解析和功能研究奠定基础.