换一批中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定
Preliminary identification of the cloning,expression,and function of Marmota himalayana type Ⅰ interferon receptor β subunit
摘要目的 克隆中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基(mhIFNAR2)的基因,并进行抗体制备及功能鉴定.方法 应用RT-PCR技术,从中国旱獭脾组织中扩增得到序列,克隆至原核表达载体pRSET-B,表达重组蛋白,电泳和Western Blot法鉴定;重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体,免疫组化、免疫荧光和Western Blot法鉴定;再通过siRNA阻断的方法检测其功能.计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 从mhIFNAR2扩增出149～1 300 bp片段,其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高,可达98.05%.成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2(50-181aa)蛋白的原核表达质粒,命名为pRSET-B.mhIFNAR2;其表达重组蛋白分子量27 kD,纯化后纯度约为95%,浓度约为160 μg/mL.用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后,获得1∶1 000的特异性多克隆抗体,用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达.合成的三条siRNA,其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比,可以沉默目的基因的表达,并能减弱干扰素的信号通路(P值均<0.05).结论 获得mhIFNAR2的部分序列,成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性,并能用于免疫组化、免疫荧光及Western Blot的检测.用siRNA277可以抑制目的基因的表达,并能阻断干扰素的信号通路.
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10.12449/JCH240210
发布时间
2024-03-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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