换一批嗜热栖热菌Argonaute蛋白的原核表达及其在KRAS 12D突变检测中的应用价值
Prokaryotic expression of Argonaute protein from Thermus thermophilus and its application value in the detection of KRAS 12D mutation
摘要目的 探讨借助基因克隆和蛋白质纯化技术获得嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)来源Argonaute蛋白(TtAgo),并于体外检测其对KRAS 12D突变的酶切活性,以期为该蛋白质后续在基因突变检测中的应用提供实验依据.方法 采用PCR从嗜热栖热菌基因组中扩增全长TtAgo基因序列,将其插入pET-28a原核表达载体,构建pET-28a-TtAgo基因重组载体,诱导TtAgo重组蛋白表达后,依次采用镍离子亲和层析(Ni-NTA)、肝素亲和层析和分子筛层析法进行纯化.通过体外实验验证TtAgo重组蛋白在短DNA单链(gDNA)介导下的高特异性核酸酶活性.结果 经基因克隆技术成功构建了 pET-28a-TtAgo原核表达载体,实现了 TtAgo重组蛋白的可溶性表达,并借助蛋白质纯化技术获得了高纯度的TtAgo重组蛋白.在gDNA的介导下,TtAgo重组蛋白能够特异性切割野生型单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)和RNA分子,但对肿瘤KRAS 12D突变型分子无切割活性.结论 成功获得了具有核酸酶活性的高纯度TtAgo重组蛋白,并在体外检测了该重组蛋白对KRAS 12D突变位点的靶向切割活性.
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关键词
嗜热栖热菌Argonaute蛋白原核表达蛋白质纯化核酸酶DNA引导链Thermus thermophilusArgonaute proteinprokaryotic expressionprotein purificationnuclease activityDNA guide strand
栏目名称
DOI
10.13602/j.cnki.jcls.2025.10.02
发布时间
2025-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
江苏大学医教协同创新基金项目（JDYY2023121）
上海市徐汇区医学重点学科项目（SHXHZDXK202322）
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