摘要目的 研究一种新型应用孕妇外周血胎儿游离DNA(cell free fetal DNA,cff-DNA)检测胎儿RHD血型基因的无创检测方法,并分析该方法的可行性及准确性.方法 以2023年8月—2024年8月本医学中心建档的RhD阴性孕妇为研究对象,采集孕妇5～8 mL外周血,首先对母亲RHD基因型进行检测,采用吸附柱法提取孕妇外周血中的基因组DNA,用PCR-SSP法检测母亲RHD基因分型,筛选出符合纳入标准的孕妇;然后采用磁珠法提取孕妇血浆中的cff-DNA,对提取得到的cff-DNA先进行质控检测,使用甲基化敏感限制性内切酶处理cff-DNA,酶切后扩增RASSF1A基因及β-actin基因,以确保提取到胎儿来源的cff-DNA;再进行胎儿RHD血型基因检测,运用巢式结合荧光探针的qPCR方法,扩增RHD第4、7、10外显子,确定胎儿RhD血型;最后对胎儿cff-DNA RHD血型基因检测结果准确性进行验证,追踪出生后新生儿血型,以其为金标准,判断孕妇外周血cff-DNA RHD血型基因检测结果的准确性.结果 收集到4例RhD阴性孕妇样本,进行母亲RHD基因分型,结果3例为RHD全缺失,1例为RHD-CE(2-9),均符合纳入标准;对孕妇外周血中提取得到的cff-DNA,酶切后质控验证,RASSF1A基因均为阳性,β-actin基因均为阴性,均提取到cff-DNA;运用cff-DNA检测胎儿RHD血型基因,结果显示4例RHD第4、7、10外显子均为阳性,判断胎儿RhD血型为RhD阳性;追溯4例新生儿,新生儿血型血清学结果为RhD阳性.结论 这种新的孕妇外周血cff-DNA检测胎儿RHD血型基因的方法可行,检测结果与出生后的新生儿血型结果一致,其对早期诊断RhD相关HDFN及指导RhD阴性孕妇应用抗D免疫球蛋白具有重要意义.