TGM1基因RNA干扰表达载体pLVX-siTGM1的构建与鉴定

Construction and Identification of RNA Interference Expression Vector pLVX-siTGM1 Targeting TGM1 Gene

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摘要目的:构建针对转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)的shRNA表达载体,通过脂质体进行HaCaT细胞内转染,筛选出最显著抑制TGM1的shRNA干扰载体.方法:构建三个针对TGM1基因的RNA干扰质粒:pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段测序分析验证构建效果.脂质体介导质粒转染HaCaT细胞.实时定量RT-PCR检测TGM1 mRNA的表达,Western blot检测TGM1蛋白的表达.结果:重组构建的三个干扰载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,三对碱基成功插入到预计位点,序列完全一致.转染三个重组干扰表达载体72小时后,RT-PCR检测TGM1基因沉默的效率,pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi分别为62.4％、73.5％和91.3％;Western blot检测TGM1蛋白的表达水平均明显降低,其中pLVX-1649shRNAi干扰载体降低最明显.结论:成功构建了TGM1 shRNA重组慢病毒载体,并且筛选出最有效抑制TGM1表达的干扰载体pLVX-1649shRNA,为进一步研究TGM1基因在鱼鳞病发病中的功能奠定基础.