换一批野生型和A294G突变型血管紧张素转换酶2基因真核表达质粒构建与鉴定
Construction of eukaryotic expression system of wild type and A294G mutant human angiotensinconverting enzyme 2
摘要目的 构建人野生型和突变型( A294G)血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因真核表达载体.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人ACE2基因,与pcDNA3.1真核表达载体连接,构建pcDNA3.1-hACE2重组质粒,通过酶切和测序进行鉴定；以此野生型ACE2真核表达载体为模板,在pyrobest DNA高保真聚合酶的作用下利用体外定点突变法构建ACE2基因突变型重组质粒,用DpnI限制性内切酶处理聚合酶链反应产物,直接转化DH5α感受态细胞,挑取克隆并提取相应质粒,测序加以验证.结果 测序结果证实,野生型和突变型ACE2基因分别插入到pcDNA3.1+中,野生型ACE2基因序列与NCBI网站人ACE2基因全长编码序列(NCBI参考序列:NM_21804.2)相应片段一致,突变型(A294G) ACE2基因除第294位碱基A被G替代以外,其余序列与野生型一致.结论 成功构建了人野生型和突变型ACE2的真核表达质粒,为下一步研究突变型ACE2的生物学功能以及ACE2在疾病发病机制中的作用奠定了基础.
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