换一批基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究
Construction of IDO1 gene knockout THP-1 cell line using CRISPR/Cas9 and its phenotype identification
摘要目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型.方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒.利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株.T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果.CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能.结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高.经PCR产物测序和Western blot验证获得了 3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能.结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDOL对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础.
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关键词
CRISPR/Cas9吲哚胺-2,3-双加氧酶1基因敲除THP-1细胞巨噬细胞CRISPR/Cas9Indoleamine 2,3-dioxygenase 1Gene knock outTHP-1 cellsMacrophage
分类号
R392.12（医学免疫学）
栏目名称
DOI
10.13431/j.cnki.immunol.j.20240013
发布时间
2024-06-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
重庆市研究生科研创新项目（CYS22344）
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