换一批
换一批利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术制备HLA-A*0201/HBc18-27单链三分子复合体
Preparation of HLA-A * 0201/HBc18-27 single-chain trimer with overlap extension PCR and homologous recombination techniques
摘要目的:构建和表达HLA-A* 0201/HBc18-27单链三分子复合体.方法:利用重叠延伸PCR将HBc 18-27、(Gly4Ser)3、β2m、(Gly4 Ser)4和HLA-A*0201胞外区依次串联为单链三聚体(single-chain trimer,SCT)融合基因,通过同源重组克隆技术插入到pET28a原核表达载体,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,采用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白,通过稀释复性法折叠成HLA-A*0201/HBc18-27的复合单体,并生物素化,将单体包被到直径4.5 μm的磁性微球,用构象特异性单抗(W6/32)进行荧光染色,流式细胞术分析其空间构象.结果:pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27基因序列和蛋白大小与预测一致;纯化后融合蛋白纯度约93％;流式细胞术分析显示pET28a-HLA-A*0201/HBc18-27单体具有正确的空间构象.结论:利用重叠延伸PCR和同源重组克隆技术成功制备了HLA-A* 0201/HBc18-27的单链复合体,无需限制性内切酶和连接酶,发展了主要组织相容性单链复合体技术,有效简化了pMHC Ⅰ类分子的制备过程.
更多相关知识
关键词
重叠延伸聚合酶链式反应同源重组主要组织相容性复合体overlap-extension polymerase chain reactionhomologous recombinationmajor histocompatibility complex
主题词
复合体(Compomers)同源重组(Homologous Recombination)组织相容性(Histocompatibility)聚合(Polymerization)蛋白(Egg White)
分类号
Q784
栏目名称
论著
DOI
10.3969/j.issn.1671-6264.2016.06.001
发布时间
2017-01-17
基金项目
江苏省科技厅科技支撑计划项目
国家自然科学基金资助项目
- 浏览188
- 被引2
- 下载16
相似文献
- 中文期刊
- 外文期刊
- 学位论文
- 会议论文
