换一批含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测
Construction of Recombinant Retroviral Vector Containing HIV-1 Tat Gene and Functional Detection of Expressed Tat in Target Cells
摘要目的:构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能.方法:使用HindⅢ将HIV-1 Tat1101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,插入到表达质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101.采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(ФNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系.免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染ФNX细胞中的表达水平.收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清,并分别感染293细胞,Westernblot检测Tat在293中表达.与此同时,收集感染293细胞培养上清,加入到HL3T1细胞(HE-La-HIV-1-LTR/CAT报告基因)中,共培养72 h后收集细胞,提取蛋白作CAT活性检测.结果:①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后,Tat在临时转染ФNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平;②临时转染病感染293细胞,Tat在感染细胞中得到了表达,且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子,使得其下游的CAT基因得到表达.结论:重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能.
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2004-01-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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