摘要目的:确定B型血友病致病基因F9的剪接位点共识序列,并筛选序列相关致病突变,以确定F9基因内含子中主要剪接调控位点.方法:从凝血因子Ⅸ(coagulation factorⅨ,FⅨ)突变数据库(FactorⅨVariant Database)中收集内含子突变,依据F9基因剪接位点保守性分析筛选可能影响剪接的致病突变,重点关注患病人数多且致病效应强的突变位点所在区域,结合3种RNA剪接预测软件对突变导致的剪接效应进行预测.之后,采用微型基因剪接检测体系,对所选突变的剪接效应进行体外检测并通过变性毛细管电泳检测不同转录本所占比例,以明确各突变剪接效应的差异,进而确定F9基因剪接共识序列中影响剪接的关键位点.针对具有蛋白编码能力的异常剪接体,构建体外表达体系,通过Western blot及活化部分凝血活酶时间综合评估异常剪接体的胞内表达、胞外分泌及凝血活性状态.结果:序列与突变分析确定F9基因外显子4剪接位点附近的15个突变为靶突变,微型基因剪接实验证实其中14个突变可导致异常剪接,对比软件预测结果,进一步证实计算机预测具有局限性,不能准确预测具体剪接模式及其比例.证实了内含子上经典位点GT-AG的保守性,同时发现供体端+5G同样有利于剪接位点的正确识别,而相对保守的+7A则未对剪接位点识别产生重要作用,此外,模拟经典"AG"序列的深层内含子突变会造成剪接识别错位,显著提高异常剪接比例.蛋白表达与活性分析结果显示,p.D93-G125delinsG和p.G94-D131del两种异常剪接突变体的抗原合成及活性状态与野生型相比差异均有统计学意义(P<0.01).结论:GT-AG是影响剪接调控的主要位点,F9基因内含子4剪接供体端非保守位点的+5G同样对剪接有调控作用.对不同突变造成剪接调控模式差异进行总结分析,可为大数据分析提供理论依据,并提高生物信息学预测的准确性.