转基因棉花中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

Development of Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for Detection of Neomycin Phosphotransferase(NPT Ⅱ)Protein in Genetically Modified Cotton(Gossypium sp.)

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摘要为了建立高灵敏度定量检测转基因棉花(Gossypium sp.)中新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)双抗体夹心酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),本研究以体外条件下制各NPTⅡ蛋白质为免疫原,制备兔(Lepus)抗NPTⅡ多克隆抗体为捕获抗体,小鼠(Mus musculus)抗NPTⅡ单克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法,以系列含量的NPTⅡ蛋白质作为标准品,建立标准曲线,对该方法各项指标进行验证,并对样品中所含NPTⅡ进行定量检测.结果表明,该双夹心ELISA对NPTⅡ检测范围为3.370～108.125 ng/mL,最低检测限为1.97 ng/mL;准确性实验回收率为96.11％～104.69％;精密性变异系数为6.58％～7.33％;与非转基因棉花内源蛋白质及其他种类转基因蛋白质无交叉反应;应用此方法对苗期转基因棉植株各部位NPTⅡ表达量进行检测,发现有明显差异.该方法特异性强,灵敏度高,准确性、重复性和稳定性好,适用于检测转基因棉花中NPTⅡ含量,能够为今后转基因作物检测方法的建立及生物安全性评价等方面提供参考,具有良好应用价值和前景.