猪P58IPK蛋白多克隆抗体的制备

Preparation of Polyclonal Antibody Against Porcine (Sus scrofa) P58IPK Protein

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摘要P58IPK(58 kD inhibitor of PKR)作为宿主细胞分子伴侣蛋白,在调节机体抗病毒反应和免疫应答方面发挥着重要作用.本研究拟克隆猪(Sus scrofa)P58IPK基因CDS序列并构建其原核表达载体,纯化P58IPK蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体,以期为后续研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)与宿主之间的互作关系提供基础材料.根据猪P58IPK全基因序列(GenBank No.HQ287801.1)设计引物,以反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法扩增P58IPK基因CDS序列(去除信号肽序列),经NdeⅠ/XbaⅠ 双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1;将其转化Arctic-ExpressTM大肠杆菌(Escherichia coli)进行诱导表达;表达产物经变性、复性及His-Band Ni+层析柱亲和纯化,将纯化产物His-P58IPK重组蛋白作为抗原免疫兔子(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体.抗体纯化后,分别利用间接ELISA和Western blot方法对其效价和特异性进行检测.结果显示,克隆所得的猪P58IPK基因CDS序列长度为1425 bp,表达产物His-P58IPK重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为54.44 kD;由此蛋白制备的多抗效价在1:512000以上,能够特异性识别目标蛋白(包括重组蛋白His-P58IPK和猪P58IPK蛋白).本研究成功克隆了猪P58IPK多克隆抗体,可为深入研究猪P58IPK蛋白功能和PCV2病毒与宿主之间的互作机制提供基础资料.