摘要目的 探讨α-1,3半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)滇南小型猪的构建及猪到恒河猴的肾脏异种移植,评估GTKO猪的有效性.方法 利用CRISPR/Cas9基因修饰系统和体细胞克隆技术构建GTKO滇南小型猪,通过聚合酶链反应、Sanger测序、免疫荧光染色等验证GTKO猪的表型.流式细胞术检测抗原抗体(IgM)结合与补体依赖细胞毒性,并进行GTKO猪到恒河猴的肾脏异种移植,监测受体猴体液免疫、细胞免疫、凝血及生理指标,利用超声检查、苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色等分析移植肾功能和病理学改变.结果 靶向滇南小型猪GGTA1基因第 4外显子设计单向导RNA(sgRNA),将pGL3-GGTA1-sgRNA1-GFP载体转染到滇南小型猪胎儿成纤维细胞中,经嘌呤霉素筛选后,获得的C59#和C89#两个细胞克隆点均鉴定为GGTA1基因敲除克隆点,经扩大培养形成细胞系后用作供体细胞进行体细胞克隆,并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中,获得 13头胎儿猪,其中F04和F11胎儿的GGTA1基因发生双等位基因突变,且F04核型正常,利用此GTKO胎儿猪进行重克隆,并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中,共获得 7头存活仔猪,其均不表达 α-Gal抗原表位.20#恒河猴血清 IgM与 GTKO猪 PBMC结合数量减少,且GTKO猪PBMC在补体依赖细胞毒性实验中的存活率高于野生型猪.获取GTKO猪肾并进行灌注直至完全变白,切除受体猴左肾后进行猪肾异位移植,血管吻合完成后开放血流,猪肾迅速变为粉红色,未发生超急性排斥反应(HAR),6 min后输尿管出现尿液,表明肾移植术成功,再切除受体右肾.移植术后 7d移植肾血流供应良好,受体猴血清肌酐水平稳定,血清钾和胱抑素C水平得到有效控制,但在移植术后10d均升高.移植术后7d受体猴体内白细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞水平均升高,血小板计数和纤维蛋白原水平均降低,而活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和凝血酶原时间均较为稳定,之后呈上升趋势.受体猴存活 10 d,尸检发现移植肾充血、肿胀和坏死,肾组织中少量IgG沉积,大量IgM、补体C3c和C4d沉积,CD68+巨噬细胞浸润.结论 GTKO滇南小型猪肾脏可在恒河猴体内维持一定时间的正常肾功能,并有效克服HAR,证实GTKO猪用于异种移植有效.