CircPTK2调节miR-761/CPEB2轴对结直肠癌细胞顺铂耐药性的影响

Influences of circPTK2 on cisplatin resistance of colorectal cancer cells by regulating the miR-761/CPEB2 axis

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摘要目的探讨环状RNA蛋白酪氨酸激酶2(circPTK2)对结直肠癌(CRC)细胞顺铂(DDP)耐药性的影响.方法收集56例CRC样本(CRC组)及癌旁正常组织样本(对照组),体外培养人CRC细胞系(LoVo、HT-29、HCT116、SW480和SW620)和人正常结直肠粘膜细胞系(FHC),并建立DDP耐药的HCT116细胞(HCT116/DDP).实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织/细胞中circPTK2、miR-761和细胞质多聚腺苷酸结合蛋白2(CPEB2)mRNA表达.取 HCT116/DDP 细胞分为对照(Control)组、si-NC 组、si-circPTK2 组、si-circPTK2+inhibitor-NC 组、si-circPTK2+miR-761 inhibitor组.细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测量各组细胞活力和DDP的半数抑制浓度(IC50)和增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell检测细胞迁移或侵袭数;Western blot检测细胞中CPEB2蛋白表达;qRT-PCR检测 circPTK2 水平;starBase 数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测 miR-761 与 circPTK2 或 CPEB2 的互补位点;将含有miR-761结合位点的circPTK2或CPEB2 3'UTR的野生型(WT)序列克隆到psiCHECK-2载体中以形成相应的荧光素酶报告载体(WT-circPTK2和WT-CPEB2),双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性;RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定Ago2或IgG RIP复合物中circPTK2、miR-761和CPEB2的富集水平.结果与对照组比较,CRC 组患者癌组织中 circPTK2、CPEB2 mRNA 表达水平升高[(2.03±0.36)vs.(1.02±0.13)、(2.55±0.44)vs.(1.01± 0.12)],而 miR-761 表达水平降低[(0.41±0.07)vs.(1.00±0.10)],差异均有统计学意义(P均＜0.001).Pearson 相关性分析结果显示,CRC患者癌组织中circPTK2表达水平与miR-761水平成负相关(r=-0.766,P＜0.001);miR-761表达水平与CPEB2 mRNA表达成负相关(r=-0.866,P＜0.001),circPTK2的表达与CPEB2 mRNA表达成正相关(r=0.653,P＜0.001).DDP耐药患者癌组织中circPTK2、CPEB2 mRNA表达水平高于DDP敏感患者,而miR-761表达水平低于DDP敏感患者,差异均有统计学意义(t=12.983、10.352、12.459,P均＜0.001).与FHC细胞比较,CRC细胞系(LoVo、HT-29、HCT116、SW480 和 SW620)中 circPTK2 和 CPEB2 mRNA 的表达水平显著升高,miR-761 的表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.001);且HCT116细胞中circPTK2和CPEB2 mRNA的表达水平高于其他CRC细胞系,miR-761的表达水平低于其他CRC细胞系,因此,选择HCT116细胞进行后续实验.与Control组和si-NC组比较,si-circPTK2组circPTK2、CPEB2 mRNA和蛋白水平显著降低,miR-761水平显著升高,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与 si-circPTK2 组、si-circPTK2+inhibitor-NC 组比较,si-circPTK2+miR-761 inhibitor 组 CPEB2 mRNA和蛋白水平显著升高,miR-761水平显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).与Control组和si-NC组比较,si-circPTK2组HCT116/DDP细胞中DDP的IC50、细胞增殖活力(48、72h)、迁移细胞数和侵袭细胞数降低,差异均有统计学意义(P 均＜0.05);与 si-circPTK2 组、si-circPTK2+inhibitor-NC 组比较,si-circPTK2+miR-761 inhibitor 组 HCT116/DDP细胞中DDP的IC50、细胞增殖活力(48、72 h)、迁移细胞数和侵袭细胞数升高,差异均有统计学意义(P均＜0.05).与Control组和si-NC组比较,si-circPTK2组HCT116/DDP细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与 si-circPTK2 组、si-circPTK2+inhibitor-NC 组比较,si-circPTK2+miR-761 inhibitor 组 HCT116/DDP 细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).生物信息学分析显示,circPTK2和miR-761存在靶向结合序列;双荧光素酶检测结果显示,与转染miR-NC比较,转染miR-761 mimic后,含有WT-circPTK2质粒细胞的荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P＜0.05);RIP检测结果显示,相对于lgG,circPTK2和miR-761在Ago2免疫沉淀中富集(P＜0.05).生物信息学分析显示,CPEB2的3'-UTR序列包含miR-761的结合位点;双荧光素酶检测结果显示,与转染miR-NC比较,转染miR-761 mimic后,含有WT-CPEB2质粒细胞的荧光素酶活性降低(P＜0.05);RIP检测结果显示,相对于lgG,miR-761 和CPEB2在Ago2免疫沉淀中富集(P＜0.05).结论 circPTK2敲低可增强耐药CRC细胞对DDP的敏感性,其作用机制可能与调节miR-761/CPEB2轴有关.