利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性

Evaluation of Developmental Toxicity of Cry1Ab Protein Through Embryonic Stem Cell Osteogenic Differentiation Experiments

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摘要目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性.方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50 μg/ml)和维生素D3(500 μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和Ⅰ型胶原的基因表达情况.结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和Ⅰ型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05).结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125～2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性.